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冷凍細(xì)胞操作步驟：

1．收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞；
2．以25μl臺(tái)盼藍(lán)溶液稀釋25μl細(xì)胞懸液；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率（至少應(yīng)該在90%以上）；
3．細(xì)胞懸液在4℃ 條件下200磄離心10分鐘；
4．將沉淀的細(xì)胞重新懸浮在冷凍液中（大約5?06細(xì)胞/0.5 ml 冷凍液）；
5．將細(xì)胞懸液加入到冷凍管中，每管0.5 ml；
6．將冷凍管置于-80℃冰箱中；
7．24小時(shí)后，將冷凍管移入液氮罐中；
8．在記錄本或電腦中記錄下每一個(gè)冷凍管的位置以確保在以后應(yīng)用時(shí)能夠找到每一個(gè)冷凍管。

傳代方法：
收到細(xì)胞后，取出培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。 （一）如果細(xì)胞未長滿，用75%酒精噴灑整 個(gè)瓶消毒后放到超菌 臺(tái)內(nèi)，嚴(yán)格無菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸出培養(yǎng)液，僅留下 10ml培養(yǎng)液在瓶內(nèi)繼 續(xù)培養(yǎng)。
（二）如果細(xì)胞已長滿，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。具體步驟如下：
1. 棄去培養(yǎng)液，用PBS（不含鈣，鎂離子）洗1-2次。
2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中， 倒轉(zhuǎn)放于37度培養(yǎng)箱1-3分鐘預(yù)熱，然后又 將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)大約30 秒后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓分 散，輕敲幾下培養(yǎng) 培養(yǎng)瓶，細(xì)胞隨即脫落下來。
3. 加入6-8ml*培養(yǎng)基，吸出，分到新的培養(yǎng)瓶中。1:3~1:6 傳代；2~3天1次。

注意：傳代后一半用我們的培養(yǎng)基，一半用你們的，以免細(xì) 胞不適應(yīng)而造成生長不好。
凍存方法：凍存液：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 +5%DMSO+20%FBS　
儲(chǔ)存：液氮儲(chǔ)存

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